我国啤酒酵母育种技术的进展
一、前言随着中国经济的不断发展，人们生活水平的不断提高，对啤酒的需求量越来越大，对啤酒质量的要求也在不断提高。酵母菌种的好坏对啤酒的质量起着至关重要的作用，可以说酵母是啤酒的灵魂。高质量的啤酒当然需要性能优良的酵母菌种。选择优良的酵母菌种，要综合考虑它的性状，包括繁殖能力、发酵速度和能力、代谢物对啤酒风味的影响、酵母的生存能力、酵母菌种的稳定性以及生产的啤酒的综合风味等。因此选育优良酵母菌种成为当今高速发展的啤酒业的需要。对酵母菌株的育种和筛选经历了一个由浅至深的过程，从根据酵母的生长代谢以及发酵能力分离较好菌种，到通过诱变进行筛选，再到细胞水平上的杂交。当今，随着生物技术的高速发展，在充分分析酵母代谢的基础上，通过分子手段来构建酵母的工程菌，使酵母拥有更多的人们希望的性能正在进行着。这很大程度上改善着啤酒的品质，给啤酒业带来了很大的便利和机遇。对酵母基因的操作一般分为两步：一是通过代谢工程来分析细胞的代谢过程，来寻求最有可能最有希望的目标，然后通过基因工程来进行基因操作，改变基因结构、删除基因或导入一新的基因。目前通过基因重组技术来改变酵母菌种的遗传特性，使它具有生产所需要的某些优良性状，在许多方面都取得了很大进展。对酵母进行的基因改造有下几个方面：1.对碳源的充分利用将曲霉菌（aspergillusniger）和乳酸克鲁维酵母（kluyveromycesmarxianus）的b-半乳醣苷酶转入酿酒酵母，使酵母可以高效率的将乳糖转化为乙醇。将裂殖酵母（schizosaccharomycespombe）的苹果酸通透酶基因转入啤酒酵母，使酵母可以顺利的降解苹果酸。将芽孢杆菌（bacillusamyloliquefaciens）的编码淀粉酶的基因和肺炎克雷氏菌（klebsiellapneumoniae）编码葡糖淀粉酶的基因转入啤酒酵母，使酵母有效的利用淀粉和糊精。将树干毕赤酵母（pichiastipitis）的木糖还原酶基因xyl1和xyl2转入啤酒酵母，使其能够利用木糖。2.提高酵母的生产力和消除酵母发酵过程中的副产物其中包括双乙酰的消除，啤酒酵母本身不含α-乙酰乳酸脱羧酶，将枯草芽孢杆菌等编码α-乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆或整合到啤酒酵母中，可大大减少双乙酰的形成。通过改变厌氧条件下对甘油的降解，可以提高酵母的发酵度。3.提高啤酒生产的操作性改善酵母凝聚性的菌种：将控制凝聚性的基因主要是flo1基因转移到非凝聚性酵母中，改善其凝聚性，发酵后便于收集酵母，啤酒过滤快。将木霉（trichodermareesei）或枯草芽孢杆菌（b.subtilis）编码β-葡聚糖酶的基因转移到啤酒酵母中，使啤酒中的高分子β-葡聚糖得以分解，降低啤酒粘度，加快啤酒过滤速度。4.用酵母来生产一些在原生物体中产量很低的蛋白从1981年hitzeman第一次用酿酒酵母表达人重组干扰素基因开始，到目前利用酿酒酵母为宿主系统表达了多种外源基因产物，如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子、人血管抑制素等。当今生物技术正快速发展，对酵母的改造研究也快速进行中。二、β-葡聚糖酶工程菌构建酿造啤酒的主要原料大麦中的β-葡聚糖含量在2-6%之间，也有些认为4-8%，因大麦栽培状况和基因型的不同而不同。在啤酒酿造过程中，麦芽中一部分β-葡聚糖进入麦芽汁，最终进入啤酒，但会增加麦芽汁的黏度。高黏度的麦芽汁以及一部分没有溶解的β-葡聚糖甚至有些溶解的β-葡聚糖都会造成麦芽汁和啤酒过滤困难。麦芽中高含量的β-葡聚糖是由于细胞壁分解的不完全，将阻滞其它贮存物质的移动，使一部分淀粉和蛋白被滞留在细胞内，最终造成浸出物的降低。在生产纯生等特制啤酒时，由于微孔滤膜的孔非常小，所以β-葡聚糖对过滤的影响比传统的啤酒酿造会产生更大的影响。麦芽汁以及啤酒的高黏度以及β-葡聚糖分子会造成微孔滤膜的阻塞。因此，酿造啤酒时啤酒以及麦芽中β-葡聚糖的含量引起人们越来越的关注。大麦中大部分的β-葡聚糖的结构是被β-1,3–键间隔开来纤维三糖和纤维四糖（2~4个葡萄糖单位β-1,4-键相连的寡聚葡聚糖）的重复结构。有少部分β-葡聚糖由β-l,4-连接而成的葡萄糖寡聚体中有更多的葡萄糖残基个数，最多可达20个左右，而且也认为这些被β-l,4-键相连的葡聚寡糖链会降低β-葡聚糖的水溶性。图1大麦中的葡聚糖主要结构以及β-葡聚糖酶的作用方式研究认为β-葡聚糖链会在麦芽生产和发酵过程中重新相互连接，特别是在冷冻和解冻的反复处理过程中，会造成β-葡聚糖分子变得更大。在啤酒酿造过程中的一些处理步骤可以使β-葡聚糖相互连接而形成更大的分子，izawa等的研究认为经过冷冻和解冻处理后出现的β-葡聚糖分子一般大于200,000，分子量大于200,000的β-葡聚糖分子与啤酒中的雾状沉淀的形成有关，也有研究认为小分子的β-葡聚糖分子也对沉淀的产生有促进作用。β-葡聚糖的浓度和正常分子大小的β-葡聚糖都是影响啤酒过滤的重要因素。β-葡聚糖是啤酒产生雾状沉淀的一个重要因素。特别是干啤和冰啤酿造过程中，过滤时出现的大分子β-葡聚糖和雾状沉淀问题更加突出。β-葡聚糖酶是破解大麦胚乳细胞壁的主要酶类。β-葡聚糖酶是酶系家族：有β-1,3-1,4-葡聚糖酶，β-1,3-葡聚糖酶，β-1,2-1,4-葡聚糖酶，β-l,4-葡聚糖酶，β-1,3-1,6-葡聚糖酶。大麦β-葡聚糖的溶解是从胚乳细胞壁的溶解开始的，在干燥的大麦原料中也存在β-葡聚糖溶解酶（β--glucansolubilase）活性，其活性会在发芽过程中增加1.5-1.7倍，β-葡聚糖的含量会因为被β-葡聚糖酶水解而降低。麦芽中β-葡聚糖酶的活性受到多方面因素的影响，比如，大麦的品种、大麦保存的年限以及大麦栽培和麦芽制备的条件。未发芽大麦中的β-葡聚糖酶的活性的高低会一定程度上影响制麦过程中β-葡聚糖的水解以及麦汁和啤酒的黏度。制麦芽过程中β-葡聚糖的降解主要是受酶活影响，在浸泡过程中β-葡聚糖的含量基本没有变化，在发芽的前三天有一明显的下降幅度，但是在随后的发芽阶段和烘焙阶段基本不再减少。长时间高温的浸泡过程虽然可以降低麦芽汁中β-葡聚糖的含量和分子大小，但也会造成浸出物减少等不良影响，所以更多的麦芽生产都是在低温条件下对大麦进行浸泡。
β-葡聚糖酶在麦芽的烘焙过程中会有一部分活性丧失。其酶活在62℃下只能存活0.5h。经鉴定β-葡聚糖溶解酶是endo-β-葡聚糖酶。研究认为β-葡聚糖酶是制麦和糖化过程中降解β-葡聚糖的主要因素。β-葡聚糖酶同时具有海带多糖酶（laminarinase(ec3.2.1.6)))和地衣多糖酶（lichenase(ec3.2.1.73)））活性。地衣多糖酶也即β-l,3-1,4-β-葡聚糖酶，是枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）产生的葡聚糖内切酶，专一性的水解与β-l,3-键相临的β-l,4-糖苷键，海带多糖酶能够水解大麦中的β-l,3-键和β-l,4-糖苷键。经赤霉酸（ga）的诱导，大麦发芽时能产生内切β-葡聚糖酶。发芽三天后的大麦中的β-葡聚糖酶活性达到最高。麦芽中的β-葡聚糖酶对热非常敏感，当麦芽在高温烘焙干燥时会使其活性很快丧失。有的研究表明在麦芽中的endo-β-葡聚糖酶活性和麦芽汁的黏度之间没有明显的关系，同样，麦芽中endo-β-葡聚糖酶的活性与麦芽生产和65℃糖化时的β-葡聚糖降解之间也不存在明显的关系。即便是麦芽制造时β-葡聚糖酶的活性水平也是很低的，所以麦芽中β-葡聚糖酶的活性并不能看作大麦胚乳细胞壁被降解的可靠指标。大麦中也存在exo-β-葡聚糖酶，但对β-葡聚糖降解的作用很小。酿造啤酒时没有被分解的β-葡聚糖会降低啤酒的过滤速度并且引起啤酒中的雾状沉淀。在啤酒酿造过程中用添加微生物生产的β-葡聚糖酶的方法来提高浸出物的产量以及阻止形成雾状沉淀。大麦和枯草芽孢杆菌中产生的β-1,3-1,4-葡聚糖酶有相同的作用底物，一些细菌产生的β-1,3-1,4-葡聚糖酶和大麦产生的β-1,3-1,4-葡聚糖酶对β-葡聚糖作用时有相同的化学作用模式。因此在制麦芽、糖化和发酵过程中添加微生物产的β-葡聚糖酶和纤维素酶以及耐热β-葡聚糖酶来促进β-葡聚糖的水解，来降低β-葡聚糖的含量和提高啤酒的过滤性。在发酵时添加枯草芽孢杆菌生产的endo-β-葡聚糖酶来水解啤酒中的β-葡聚糖和增加啤酒的过滤性。在生产干啤时，发酵液中添加20ppm的β-葡聚糖酶可使微孔滤膜的过滤性提高7倍。酵母细胞壁的主要的结构成分是β-1,3-葡聚糖，在一些酵母的细胞壁组成中也有α-1,3-葡聚糖，但是酵母中没有能水解α-1,3-葡聚糖的酶。酵母中存在两大类的β-1,3-葡聚糖酶：内切-β-1,3-葡聚糖酶（ec3.2.1.58）和外切-β-1,3-葡聚糖酶(ec3.2.1.39)。外切-β-1,3-葡聚糖酶在β-葡聚的水解中起大部分作用，能从糖链的非还原端作用产生葡萄糖，他们还能够水解β-1,6–糖苷键。而内切-β-1,3-葡聚糖酶可以从糖链的内部任意位置作用，产生低聚糖和少数的葡萄糖。葡聚糖的降解一般由内切-和外切葡聚糖酶共同作用完成。许多酵母菌株能够产生葡聚糖酶系都有β-1,3-以及β-1,6-活性，但是没有具有β-1,4-活性的酶。borriss的研究表明，大多数的杆菌中分泌的内切-β葡聚糖酶对地衣多糖和大麦β-葡聚糖有专一性，属于地衣多糖酶系，对β-l,3-1,4-β-葡聚糖有水解作用。912348:（本文已被浏览0次）枯草芽孢杆菌能够分泌对啤酒工业非常有用的β-l,3-1,4-β-葡聚糖酶，能够专一性的降解大麦葡聚糖和地衣多糖。它有键专一性，能专一性的水解与β-l,3-键相临的β-l,4-键，这与酿酒酵母分泌的外-β-l,3-葡聚糖酶水解β-l,6-键和与有β-l,3-键葡萄糖残基的β-l,3-键的性质是明显区别的。cummings等用表达载体在gal1基因启动子控制下控制在酿酒酵母中表达里氏木霉（trichodermareesei）的β-葡聚糖酶基因显示活体酶能够分泌到培养介质中，但破碎细胞实验证明活性的酶蛋白主要存在于原生质周围的间隙中。分泌的酶蛋白由于高度的n-端糖基化而使分子量比里氏木霉表达的要大的多。外源基因在酵母中的表达量会受启动子的很大影响。cantwell等将枯草芽孢杆菌的β-l,3-1,4-β-葡聚糖酶基因在酵母本身的不同种类的启动子的作用下，用不同的表达载体在酿酒酵母中表达，结果显示在adh1启动子作用下产量比cyc1启动子高1000倍。penttila等将里氏木霉的两个编码内切β-l,3-葡聚糖酶的基因克隆并在磷酸甘油酸激酶启动子(pgk1p)的控制下在酿酒酵母中表达，活性酶分子被分泌到培养介质中。由于在两种生物中进行的n端糖基化的不同而使β-l,3-葡聚糖酶在这酿酒酵母和里氏木霉中在大小上有所差别。而且能够产β-l,3-β-葡聚糖酶的酵母细胞的形态与正常的酵母细胞有所差别。vanrensburg等在酿酒酵母中用表达质粒在adh2p和adh2t控制酿酒酵母的exo-β-l,3-葡聚糖酶、枯草芽孢杆菌endo-β-l,3-1,4-葡聚糖酶和溶纤维丁酸弧菌(butyrivibriofibrisolvens)的endo-β-1,4-β-葡聚糖酶基因的同时表达，共表达的几个基因并没有明显的提高对β-葡聚糖的降解作用。但这个大的连接的基因片段的表达要比小的基因片段时间上推迟一些，推测可能是由于大基因片段的表达和修饰需要更多的时间。olsen等用酵母转化酵素信号肽，在磷酸甘油酸激酶启动子的作用下将大麦的β-l,3-1,4-β-葡聚糖酶基因克隆到酵母细胞中得到表达。黑曲霉的内切β-1,3-葡聚糖酶被克隆到质粒中，在gapdh启动子和终止子的控制下酿酒酵母中表达，但没有检测到酶活。但对其基因表达产物的提取纯化后的测定显示有酶活，酶在80℃高温下经过一小时还有56%的酶存活，在40℃下用蛋白酶处理三天后还有80%的酶存活，表现出极大的稳定性。
外源基因在酵母中表达时可能会因为修饰等原因造成基因的不正常表达。wang等分别在大肠杆菌和酵母中用表达质粒表达一丝状真菌(macrophominaphaseolina)的β-1,4-β-葡聚糖酶基因，发现表达出来的产物有不同的性质和结构。在大肠杆菌中表达的酶蛋白为30kda，最适温度为60℃；而在酿酒酵母中表达的产物为一高度糖基化的约60kda的蛋白，过度的糖基化限制了酶的活性，要比大肠杆菌中低，而且其最适反应温度为40℃。nakajima等用酵母转化酵素信号肽引导，在gal1启动子的控制下表达了一87kd的环状芽孢杆菌（bacilluscirculans）的β-1,3-葡聚糖酶，但在低温下经过很长的时间后才在培养介质中发现β-1,3-葡聚糖酶活性，而且表达的酶蛋白也比在大肠杆菌中表达的要大。国内从1992年开始有β-葡聚糖酶基因在酵母中表达的报道。陈永青等在1992年也将枯草芽孢杆菌的β-l,3-1,4-β-葡聚糖酶基因克隆到一细菌酵母穿梭质粒中，然后分别在大肠杆菌和酵母中得到表达，在大肠杆菌中有更高的表达水平。随后细菌的β-1,4-内切葡聚糖酶基因、里氏木霉β-1,3-内切葡聚糖酶等在酵母中得到表达。这些研究都是以实验室里的酵母为材料，而不是以工业应用为目的。汤晓颖等将里氏木霉内切β-葡聚糖酶基因在啤酒酵母中的整合和表达是以工业酿酒酵母为材料，在adh1启动子和终止子的控制下用整合型质粒做载体在酵母中进行同源重组，得到了表达葡聚糖酶活性的酵母菌株。。三、蛋白酶a缺陷型基因工程菌的构建啤酒泡沫的质量是啤酒的一个重要的品质。啤酒泡沫的质量包括泡沫的数量、稳定性、挂壁性、白皙度、浓度、粘度和强度等一系列具有内在关联的特性。但这些性质中最重要的是泡沫的稳定性，因为如果没有泡沫的稳定性，那么其他的性质都将不复存在。啤酒的泡沫是由酿造工艺和原料决定的，而且促进泡沫的形成和稳定性受一系列因素的影响。蛋白多肽、金属离子、类黑精、异-α-酸等是泡沫促进剂，而脂质、基本氨基酸以及高浓度的乙醇等对啤酒泡沫有抑制作用。一般认为异-α-酸和啤酒中多肽的相互作用是泡沫稳定性的基础。影响啤酒泡沫的蛋白主要来自麦芽，它们对啤酒泡沫的影响与分子大小、表面粘度活性、疏水性、等电点及蛋白含量等均有关。分子量大于5000、活性粘度高、疏水性强、等电点高的蛋白均能增强泡沫稳定性，泡沫蛋白浓度越高，稳定性越好。组成泡沫的物质有二氧化碳、起泡蛋白、酒花中的苦味质及β-葡聚糖，金属离子等。其中二氧化碳、起泡蛋白和异葎草酮是构成啤酒泡沫的三大基本要素。起泡蛋白、酒花树脂等表面活性物质，有降低啤酒表面张力的作用，故可以形成较多的泡沫；异α-酸表面粘度高，有利于泡沫的持久和挂杯；亲水性的多糖，能提高泡沫膜的牢固性；金属离子则起到保护泡沫持久性的作用。在组成啤酒泡沫的三大要素中，蛋白质是影响啤酒泡沫的关键物质，因此，国外学者对啤酒泡沫蛋白做了较多研究。通过生化、免疫学及分子生物学的研究，目前已经了解到啤酒中一些特征性的泡沫阳性蛋白。泡沫阳性蛋白是指其水平含量可反映泡沫质量的多肽。很多研究者认为，较高分子量多肽能增强泡沫稳定性，于是将其认定为泡沫阳性蛋白。免疫化学分析已经证实，啤酒泡沫阳性蛋白主要来自大麦醇溶蛋白；也有少部分的蛋白分子量大于50,000，有些研究表明分子量200,000左右的蛋白来自于酵母。促进产生泡沫和泡沫稳定性的主要几种蛋白质是：蛋白z（proteinz），其分子量约40kda；另一种分子量为9.6kda的脂类转移蛋白1(ltp1)。还有大麦醇溶蛋白（hordein）以及谷蛋白碎片（glutelinfragments）也对泡沫稳定性有影响。其中蛋白z和脂类转移蛋白1来自大麦，是啤酒中主要的蛋白，这些蛋白以及一些泡沫影响因素相互作用来促进啤酒泡沫的稳定性。蛋白z和脂类转移蛋白1能够耐受高温和蛋白水解酶的作用，因而对泡沫的稳定性有重要的作用。很多学者认为蛋白z和ltp1是主要的与泡沫稳定性有关的特征性啤酒多肽。蛋白z，分子量为40,000，是第一个被人们与啤酒泡沫的稳定性联系在一起的蛋白。该蛋白有两个异构体形式，即蛋白z4(bsz4，约占80%)和蛋白z7(bsz7，约占20%)。它是啤酒中主要的蛋白。curonietal(1995)认为高度糖基化的蛋白z能提高啤酒泡沫的稳定性。蛋白z是啤酒蛋白中表面黏度和弹性最高的蛋白。脂质转移蛋白1（ltp1）分子量约为9,700，是高浓度的存在于啤酒泡沫中的疏水蛋白，在煮沸过程中不可恢复的变性而改变其免疫反应性并提高其促进泡沫产生的能力。就单一的啤酒中的ltp1来说，有很强的产生泡沫的能力，但其产生的泡沫的稳定性较差。但它跟低分子量大麦醇溶蛋白或谷蛋白，或高分子量泡沫蛋白部分相互作用，可以提高泡沫的质量以及泡沫的稳定性。bech(1995)等认为增加啤酒中ltp1的含量可以提高泡沫的稳定性。clarketal（1994）报道ltp1主要是通过减少降低啤酒泡沫稳定性的脂类而影响泡沫质量。evans(1999)等报道，大麦品种不同，啤酒泡沫稳定值变化幅度达24%，由于所分析大麦中蛋白z及ltp1水平不同，所以该作者认为啤酒泡沫性能不同的部分原因是其麦芽中蛋白z及ltp1含量不同所致；maedaetal（1991）认为蛋白z与啤酒中其它蛋白相比，其活性粘度最高，因此对泡沫稳定性影响最大。蛋白z和ltp1都包含蛋白酶抗性序列并且对热稳定，因此在麦芽制造及酿酒过程中经历较小的水解变化，分子量基本保持不变，并保持免疫活性。9712348:（本文已被浏览1次）除上述影响熟啤酒泡沫的因素外，由于纯生啤酒未经过巴氏杀菌，因此啤酒中残留的蛋白酶也是造成纯生啤酒存放过程中泡沫衰减的一个主要因素。一般说来，啤酒酿造过程中蛋白酶主要有2个来源。一是来源于麦芽，在大麦发芽时会有自然蛋白酶产生，它可以降解蛋白质产生足够的有泡沫稳定性的多肽；二是来源于酵母，酵母含有多种蛋白酶，主要的有蛋白酶a(pra)、蛋白酶b、羧肽酶y和s，氨肽酶co和i，二肽酰氨肽酶等。由于来自麦芽的蛋白酶经麦汁煮沸后即失去活性，因此不会对啤酒泡沫稳定性产生影响。来自酵母的蛋白酶根据其水解部位分为两大类：蛋白内切酶（蛋白酶a和b）和蛋白外切酶（羧肽酶和氨肽酶），由于与泡沫有关的蛋白分子较大，因此作用于这些蛋白的酵母蛋白酶不会是仅能水解小分子肽的蛋白外切酶，而蛋白酶b在ph5左右时甚至在低于5oc的温度下也极不稳定，很快失去活性，并且羧肽酶及蛋白酶b的最适ph均偏碱性（~ph8），在酸性条件下尤其是啤酒环境中（~ph4.5）这两种酶基本没有活性，因此对啤酒泡沫产生影响的主要是酵母蛋白酶a。酵母细胞中的蛋白酶主要是pra、蛋白酶b和数种氨肽酶和羧肽酶。其中pra对泡沫阳性蛋白的含量影响最大。由于啤酒的ph值在4.0-4.5之间，贮存过程中还会略有下降，正好位于酵母pra作用的ph范围，泡沫蛋白很容易被酵母pra作用而改变其性质，因此酵母分泌到啤酒中的pra是造成纯生啤酒存放过程中泡沫衰减的一个主要因素。shimizu认为蛋白酶a可以改变疏水蛋白的疏水特性，而疏水蛋白是泡沫的促进因子，因而使泡沫的稳定性下降。酵母蛋白酶a对啤酒泡沫稳定性的负面影响已被证实，它能够使啤酒泡沫的稳定性迅速下降。蛋白酶a是一种天冬氨酸蛋白酶(asparticproteinase)，由pep4基因编码，位于酿酒酵母细胞的液泡内，一般认为酵母通过自我裂解的方式从液泡中向培养介质中释放蛋白酶a，但maddox认为酵母活细胞在外界压力下也可能通过细胞壁向介质中释放蛋白酶，这种观点当今已经被普遍接受。当麦芽汁暴露在蛋白酶a下时，麦汁中蛋白的大小并没有多少改变，但其结构发生了改变，进而改变了其疏水性，因此stephan等认为蛋白酶a对啤酒中蛋白的作用方式是改变蛋白的疏水性，而不是分解蛋白分子。而且ltp1表现出对蛋白酶a的忍耐力。rena等也认为蛋白酶a通过改变ltp1构造，使ltp1变性或糖基化，进而影响泡沫的稳定性。认为通过减少发酵液中的死亡的酵母细胞而减少酵母自我裂解而释放蛋白酶a的机会来避免其对泡沫产生影响，可以通过采用低蛋白酶a活性的酵母、低温发酵和后酵以及在发酵结束后迅速把酵母分离的方式来降低蛋白酶a对泡沫的影响。kondo等对啤酒酿造过程中的蛋白酶a活性影响因素进行了研究，发现蛋白酶a活性与诸多因素有关。酵母菌株不同，蛋白酶a活力也不同，三倍体及多倍体菌株比单倍体和二倍体菌株蛋白酶a分泌量要多。发酵过程中，酵母活力越高，分泌的蛋白酶a越少；随着酵母活力的降低，蛋白酶a分泌量增多，蛋白酶a活性也逐渐增高，营养物质被酵母细胞同化后蛋白酶a活性急剧增大，发酵终了时达最大值。在低氮条件下，特别是氨基酸含量较低时发酵，蛋白酶a分泌量要比氮源充足时分泌的多，因此，初始麦芽汁的营养条件对蛋白酶a活性有重要影响。啤酒酿造过程中酵母细胞胞液ph条件不同，蛋白酶a分泌量也有所不同，发酵中酵母细胞胞液ph越高，蛋白酶a分泌量越低；发酵终了时酵母胞液ph降低，此时酵母活力也下降，酵母蛋白酶a分泌增多。因此在发酵结束时通过测定蛋白酶a活力可以判断酵母活力，从而确定啤酒酿造过程中酵母回收时间，以保证酵母发酵性能稳定及蛋白酶a低活性。酵母储存时间越长，后酵过程中酵母活力越低，蛋白酶a分泌量越多；储存温度越高，蛋白酶a分泌越多。因此，为了减少啤酒中蛋白酶a活性，酵母应短期、低温储存。酵母蛋白酶a是引起纯生啤酒泡沫衰减的主要因素，因此通过添加酵母蛋白酶a的抑制剂也可以提高纯生啤酒泡沫稳定性。但采用此方法时，对于化学抑制剂要考虑其安全性问题；生物抑制剂则要避免成本太高。影响啤酒泡沫的因素很多，虽然已经从原料选择与工艺控制、抑制剂对啤酒进行后修饰、培育富含泡沫阳性蛋白大麦品种等手段来减少泡沫不利因素的影响来促进泡沫的稳定性和泡沫质量。酵母蛋白酶a是影响纯生啤酒泡沫稳定性的关键因素，上述措施的实施固然重要，但要从根本上改善纯生啤酒泡沫性能，必须设法建立酵母蛋白酶a缺陷型菌株。鉴于该酶的基因结构已比较清楚，因此，通过现代分子生物学手段可以从根本上灭活酵母蛋白酶a，只有这样，纯生啤酒存放过程中泡沫衰减问题才能得到真正解决。关于基因缺失株的研究，国外虽然已经有构建好的酵母蛋白酶a缺失株(saccharomycesgenomedeletionprojectweb)，但由于他们的研究目的多集中在功能研究方面，因此所用菌株一般是营养缺陷型菌株。而对酵母菌株蛋白酶a基因敲除进行发酵性能的研究国外未见报道。王肇悦等用工业酵母菌株为材料，用同源重组的手段得到蛋白酶a基因敲除的菌株。对改造的菌株和出发菌株的蛋白酶a活性的比较发现出发菌株中存在蛋白酶a酶活，而改造的菌株中蛋白酶a活性丧失。采用pcr介导的基因中断法对工业用啤酒酵母进行了其蛋白酶a编码基因pep4的基因敲除，以期获得具有优良泡沫性能的纯生啤酒酵母菌株。
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